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8种定制方案检测方案全面升级
抗体药物偶联物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）是通过一个化学链接将具有生物活性的细胞毒性药物连接到单抗上。大多数ADC药物开发都要依赖于抗体的内吞作用。抗体能否被内化主要由靶点决定，而抗体内化的效率则与抗原密度、抗体亲和力以及抗体与抗原结合表位密切相关。同一靶点的不同抗体也会表现出不同的内化效率。所以，高亲和力，高内化效率的抗体的筛选，成为ADC药物靶向性和安全性的重要保证。金斯瑞蓬勃生物给您提供多样化的高效，稳定的抗体内化实验平台，帮助您快速，高通量筛选ADC候选分子。
全面的平台
检测方案升级
丰富的经验
金斯瑞蓬勃生物可提供针对抗体的内化实验，以及针对于ADC或单毒素分子的细胞毒性试验，可根据客户需求提供以下7个方案：
使用Incucyte®活细胞分析仪，可以直接在96孔板中检测抗体内化，只需一步添加染料，即可实现抗体内化的快速、动力学、高通量分析。
检测优势：
✓ 不同于终点检测，单次实验同时评估抗体内化的时间依赖性变化和浓度依赖曲线，可用于药理学动态定量分析
✓ 活细胞实时观察，连续监测可长达72小时，最小检测间隔15分钟
✓ 可用于抗体的高通量筛选
使用对pH值敏感的抗体标记荧光染料(Incucyte®Fabfluor-pH)，与抗体的Fc端结合形成Fab-Ab-Dye复合物，在常规培养基中(pH7.0)，Fab-Ab-Dye几乎没有荧光，内化进入核内体及溶酶体后，其环境pH降低(pH4.7—6.3)，Fab-Ab-Dye发出明亮的红色荧光。使用Incucyte®活细胞分析仪，可在96孔板中实时检测到抗体内化的动态变化。
Live-CellAnalyzerIncucyte®
图1.基于实时活细胞成像内化检测原理
图2a显示使用Incucyte®FabFluor标记的抗ROR1抗体(UC-961)或hIgG1同型对照处理细胞，抗ROR1抗体随时间增加，内化水平逐渐升高。图2b显示抗DDR1抗体(AB3E3)处理的CHO-K1/DDR1细胞在红色靶区迅速增加，并显示出量效曲线。
图2.基于实时活细胞成像内化筛选方法
金斯瑞蓬勃生物使用一种重组免疫毒素(Immunotoxin，IT)和待测抗体偶联,该mAb-IT复合物被靶细胞内化后，IT释放到细胞质中，导致延伸因子(EF)-2的ADP-核糖基化，随后通过抑制蛋白质翻译机制并最终产生细胞毒性。通过检测细胞杀伤来评估抗体的内化效果。
图3.免疫毒素诱导的细胞毒性测试
特异性强： 只有当mAb-IT偶联物被靶细胞内化时才会显著降低细胞活力，游离的免疫毒素并不会产生细胞毒性;
内化效率高： 与传统的mAb-ZAP方法相比，mAb-IT偶联物的分子量更稳定，内化效率更高;
适用性广： 适用于杂交瘤技术的早期上清阶段筛选；可应用于不同物种（如人、小鼠、兔、山羊）、不同抗体亚型;
成本低： mAb-IT偶联物可以模拟ADC药物的MOA，且制备简单。
图4.基于免疫毒素偶联的内化筛选方法
免疫毒素结合曲妥珠单抗与SK-BR-3细胞孵育24-48小时，通过与单抗结合的免疫毒素诱导的细胞毒性，测定曲妥珠单抗的剂量依赖性内化率。
基于pH探针的内化检测：pH被酸碱度敏感pH探针标记的抗体只有在被靶细胞吞噬进入胞内体被酸化之后才会释放荧光信号，可以使用流式细胞仪捕捉并分析该荧光信号。
基于细胞表面二抗追踪的内化检测：选用37℃和4℃分别孵育待测抗体，使用二抗标记法，追踪抗体内化水平。
这两种经典的内化筛选方法因方法简便，只需流式细胞仪即可检测，因而被广泛的应用于ADC裸抗筛选中。但该两种方法采用终点式检测，每次检测只能获得单一时间点的分析，检测可能会出现因缺少环境控制而导致细胞状态变化。
图5. pH探针法
案例1：pH探针法
用pH探针追踪单抗在活细胞中的内化水平抗体与pH探针孵育后，经过内化，抗体依次转位到溶酶体中，其中酸性pH诱导pH探针荧光增强
案例2：二抗标记法
基于细胞表面荧光的流式细胞术内化分析，细胞表面剩余抗体用二抗量化，间接反映细胞内化效率
细胞毒性检测实验可用于衡量细胞毒性化合物引起细胞损伤或细胞死亡的能力，是评估化合物用途和药效的关键因素。
使用CellTiter-Glo®细胞活力试剂盒测定，量效曲线数据显示待测ADC样品抑制SK-BR-3细胞活力。